非天然糖核苷酸的合成及其應用

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on style="text-indent: 0em; white-space: normal; line-height: 1.75em; margin-bottom: 20px;">盡管自然界中的碳水化合物和糖復合物結構十分復雜,但人的糖蛋白和糖脂僅有九種構成單元:葡萄糖(glucose, Glc)、半乳糖(galactose, Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)、N-乙酰氨基半乳糖(N-acetylgalactosamine, GalNAc)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid, GlcA)、木糖(xylose, Xyl)、甘露糖(mannose, Man)、巖藻糖(fucose, Fuc)和N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac)(如圖1[1]。這些構成單元必須被活化為糖核苷酸后,才能參與到不同糖鏈的構建中[2, 3]。

糖核苷酸在結構上可分為兩類:核苷二磷酸(nucleoside diphosphate, NDP)糖和核苷一磷酸(nucleoside monophosphate, NMP)糖,其中NDP-糖最為常見。尿苷二磷酸(uridine diphosphate, UDP)單糖是最常見的NDP-糖供體,在多糖生物合成途徑中,它們能夠被糖基轉移酶或者合酶轉移到糖基受體上構建糖苷鍵。
天然和非天然UDP-糖都能夠通過化學、酶法和化學酶法來合成[4-7]。雖然已有很多文獻報道了天然UDP-糖的合成方法,但是目前針對非天然UDP-糖的合成和應用的探索還相對匱乏。這些非天然糖基供體有很大的應用前景,可作為酶底物用于功能性多糖和糖復合物的合成、酶抑制劑研究以及各種活性測試[4, 8]。因此,非天然糖核苷酸的合成在過去十年間一直都是研究熱點。Wagner等人總結了從1999年到2009NDP-糖、NMP-糖及其衍生物化學合成進展[4],Thorson等人在2011年發表的有關糖基化的文章中詳細總結了糖核苷酸的酶促合成途徑(尤其是包括端基異構激酶和焦磷酸化酶的合成方法)及其底物和酶催化的轉化[9]。
這里,我們總結了非天然糖核苷酸,特別是尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖(uridine diphosphate-N-acetylglucosamine, UDP-GlcNAc/尿苷二磷酸乙酰氨基半乳糖(uridine diphosphate-N-acetylgalactosamine, UDP-GalNAc)類似物的化學法、酶促法和化學酶法制備方面的進展,及其在生理和藥理學方面的生物技術應用。由于很難通過修飾天然糖核苷酸來獲得非天然糖核苷酸[4],目前研究中主要由兩步法合成策略來實現非天然糖基供體的合成:第一步是糖-1-磷酸(sugar-1-P)的合成,可以在此階段實現結構的衍生化;第二步是二磷酸鍵的形成。同時,我們也介紹了糖核苷酸在過去十年中的新應用,包括碳鏈長度可控多糖的合成,穩定的同位素標記技術,酶促和代謝生物正交策略以及結構-活性關系(structure activity relationships, SAR)研究等。

1. 常見糖核苷酸

1    糖核苷酸的合成

常見的糖核苷酸中的大多數共有相似的生物合成途徑,即由6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖作為關鍵中間體,以激酶和核苷酸轉移酶作為關鍵酶。GlcNAcGalNAc是很多重要多糖或糖復合物(比如糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs))的基本構成單元,所以對它們相應的核苷酸供體(即UDP-GlcNAcUDP-GalNAc)的研究最為廣泛[10,11]。在生物合成途徑中,通常是由酶催化葡萄糖(de novo pathway)或GlcNAc/GalNAcsalvage pathways)生成糖環1-位單磷酸化的中間產物GlcNAc-1-磷酸(GlcNAc-1-P),再對GlcNAc-1-P進行酶促焦磷酸化從而合成二磷酸供體UDP-GlcNAc[12]。UDP-GlcNAc/GalNAc的生物合成也可被進一步簡化:用6-激酶將糖轉化為的糖-6-P,糖-6-P再經變位酶轉化為糖-1-P,糖-1-P緊接著被尿苷三磷酸(UTP)焦磷酸化得到UDP-糖(如圖2[5]。

2. UDP-GlcNAc/GalNAc的生物合成途徑

根據生物合成途徑得知,核苷二磷酸糖合成的關鍵步驟是在核苷的5'-OH位和糖的異頭羥基之間引入焦磷酸基團(如圖3[4]。目前研究中常用兩種途徑進行合成,第一種方法是將含離去基團的糖基供體(如鹵化物)和核苷5'-二磷酸直接進行糖基化(如圖3,path A)。但這種方法較難控制糖苷鍵的立體選擇性。第二種方法是KhoranaMoffat開發的,目前更流行(如圖3,path B):耦合單糖-1-磷酸和活化的核苷5'-單磷酸鹽(如核苷磷酸嗎啡酸鹽)來構建焦磷酸鍵,最終產物的糖苷鍵構型可以通過糖-1-磷酸的立體選擇性來控制[13,14]。

3. UDP-糖的一般合成途徑

1.1    α-連接構型的糖-1-磷酸的合成

一般而言,控制糖-1-P的立體構型,再將其與活化的核苷5'-單磷酸酯偶聯,可以控制UDP-糖基供體糖環和焦磷酸部分之間的糖苷鍵構型。到目前為止,對α-連接構型的糖-1-磷酸的合成方法的研究較為深入。

1.1.1    麥克唐納反應(MacDonald reaction

麥克唐納反應是一種用于糖的單磷酸化的經典方法,反應過程是全乙;Wo的單糖與磷酸在真空下進行的化學反應,以高選擇性生成α-連接構型的糖-1-磷酸[15]。在這個反應的基礎上,Masuko等人以30%-50%的產率構建了一個小型非天然GlcNAc-1-PGlcNAc-1-P衍生物庫(如圖4[16]。他們也證實了疊氮基和炔基在這種酸性條件下較穩定,因此,可以進一步通過點擊化學反應進行熒光基團標記。
UDP-三氟乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNTFA)是在化學酶法合成硫酸乙酰肝素和肝素中一種常用的糖基供體,而在麥克唐納反應的條件下三氟乙酰氨基也很穩定,所以也可以利用該反應合成α-連接構型GlcNTFA-1-P[17]。該方法也可用于其他糖核苷酸的合成,如α-D-阿拉伯呋喃糖-1-磷酸(α-D-arabinofuranose-1-phosphate, Ara-1-P[18]、3-脫氧-α-D-阿拉伯己糖-1-磷酸[19]2-脫氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸[19]。然而,麥克唐納反應的反應條件較為苛刻,一般不適用于熱穩定性差的糖的合成,而且其產率普遍偏低,這限制了該方法進一步的應用[4]。

4. 通過麥克唐納反應合成GlcNAc/GalNAc-1-磷酸類似物

1.1.2    對半縮醛羥基進行磷酸化反應

對糖環半縮醛羥基C-1-OH直接進行磷酸化是另一種構建α-構型糖-1-P的有效方法。半縮醛羥基和磷酸化試劑反應后能獲得保護基保護的α-構型單磷酸,然后經過催化加氫即可將磷酸鹽上的保護基團去除,獲得α-連接構型糖-1-P。SabesanNeira等人通過4-二甲基氨基吡啶4-dimethylaminopyridine, DMAP)催化糖半縮醛和二苯基膦酰氯耦合構建了α-糖苷鍵[20]。Dinev等人用同樣方法制備了13C標記的全乙;葡萄糖-1-磷酸,其產率為83%(如圖5-I)[21]。Schultz等人在二異丙基氨基鋰lithium diisopropylamide, LDA)存在下用四芐基焦磷酸進行磷酸化,生成了高α-選擇性的磷酸化產物(如圖5-II[22,23]。他們發現氟、疊氮基在這種條件下也很穩定,從而可以構建氟、疊氮基修飾的非天然糖基供體。Feng等人(如圖5-III)通過三氮唑催化二芐基二乙基胺基膦(dibenzyl N,N-diethylphosphoramidite, DDP)與半縮醛,生成亞磷酸鹽,隨后氧化得到糖-1-P。雖然此反應沒有立體選擇性,產物為α,β混合物(α:β=1:1[24],但后續在四氫呋喃中用叔丁基過氧化氫t-BuOOH)處理這兩種異構體時,β-構型的產物能快速異構化為α-異構體。但是,在選擇氧化劑時,如果使用過氧化氫(H2O2),會破壞O-P鍵生成副產物。同樣,Graziani等用雙(芐氧基)-N,N-二異丙基氨基-磷化氫/1H-四唑成功合成了GDP-D-甘油-α-D-甘露庚糖,然后用叔丁基過氧化氫(tert-Butyl hydroperoxide, TBHP)氧化制備了關鍵的中間體α-磷酸鹽[25]。該方法還可用于合成一系列糖-1-磷酸酯,例如D-甘露糖醛酸(D-mannuronic acid, ManA-1-P[26],N-乙;蛩幔N-acetylmuramic acid, MurNAc-1-P[27],2-脫氧-α-D-葡萄糖-1-P,3-脫氧-α-D-阿拉伯己糖-1-Pα-D-來蘇糖-1-P4-脫氧-α-D-lyxo-hexose-1-P[19]。

5. 糖半縮醛和磷酸化試劑間的縮合生成α-連接異頭磷酸鹽

1.1.3    酶法途徑

由于糖核苷酸在有機溶劑中的溶解度較低,且糖苷鍵和焦磷酸鍵不耐水解,通過傳統化學方法合成糖核苷酸非常具有挑戰性。另外,在化學合成過程中通常涉及多步的保護基操作和異構體分離純化,其過程繁瑣、產率低下。而酶法合成利用了酶催化的高效選擇性,能夠模擬糖苷鍵生物合成途徑,具有高立體選擇性和高區域選擇性,有廣泛的應用前景[5]。
NahKN-acetylhexosamine kinase)是一種N-乙酰己糖胺激酶,也是第一個被報道的野生型葡萄糖型1-激酶,可以快速有效地催化GlcNAc受體和5'-三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)磷酸供體合成GlcNAc-1-P[28]。ZhaoCai等人利用這種酶成功將非天然的GlcNAc/GalNAc類似物轉換成了它們的1-磷酸化產物。并且他們發現這種酶的底物適用性非常好,無論糖環的C-4位羥基是平伏鍵或豎立鍵,都不影響酶對底物的識別(如圖6[29,30]。更重要的是,對糖底物的N-;M行多種正交基團的修飾,也不影響酶的識別。因此,通過此方法可以成功將一些正交基團標記到糖或糖復合物結構中去,便于進一步進行生物活性研究。另外,NahK可以與其他兩種酶(Pasteurella multocida N-acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferasepm, PmGlmUPasteurella multocida inorganic pyrophosphatase, PmPpA)結合使用,從而一鍋法合成UDP糖衍生物,大大簡化了合成過程[31]。

6. NahK酶法合成GlcNAc/GalNAc-1-P衍生物

1.2    β-鍵構型的糖-1-磷酸的合成
由于糖環端基的異構效應,相比α-構型,β-構型的吡喃糖磷酸很不穩定,所以其合成頗具挑戰性。前面介紹的方法都無法實現β-構型的構建,目前也很少有文獻報導β-鍵構型的糖-1-磷酸的合成。Oberthür等人利用α-構型糖基鹵化物和四丁胺鹽之間的SN2取代反應合成了β-構型2-脫氧糖磷酸(如圖7-I)[32]。他們發現,更穩定的異頭離去基團有助于磷酸化反應從SN1轉換為SN2路徑。同時,鄰近基團的參與有助于磷酸化步驟中的立體控制。Timmons等人通過乙;虮郊;Wo的糖基溴化物和磷酸二芐酯的偶聯,成功合成了β-L-巖藻糖/鼠李糖-1-磷酸(如圖7-II)[33]。

7. 化學合成β-連接的糖-1-P

Prihar等人用鄰亞苯基氯膦酸將甘露吡喃糖的半縮醛羥基磷酸化,得到β-D-甘露吡喃糖基-1-P[34]。同時,他們還使用MacDonald反應獲得了β-α-L-巖藻呋喃糖-1-磷酸的混合物(β:α=12:5[35]。此外,酶促途徑也可以實現β-構型糖-1-P的合成,如Stiller等人使用巖藻糖激酶合成了β-L-巖藻糖-1-P[36]。

1.3    二磷酸鍵的構建

1.3.1    化學法

在化學法構建二磷酸鍵過程中,使用催化劑或各種活性核苷磷酸嗎啡啉酸酯,可以改善從糖-1-P轉化為UDP糖的反應時間和收率。例如,磷酸和尿苷-單磷酸嗎啡啉鹽在吡啶中的偶聯效率很有限[25],引入催化劑1H-四唑后則能顯著加快反應效率(如圖8-I),而uridine 5′-monophosphomorpholidate 4-morpholine-N,N-dicyclohexylcarboxamidine salt是在生產UDP-糖過程中最常見的活性單磷酸嗎啡啉鹽試劑[22]。此外,一鍋法也能有效提高得率,Gold等人基于糖磷酸鹽和核苷亞磷酰胺的耦合,同步原位完成了活化、氧化和去保護,快速合成了UDP-N-乙酰氨基己糖衍生物。其中,中間產物中的亞磷酸基團可直接被t-BuOOH氧化成磷酸基,從而生成目標供體(如圖8-II)[37]。除了UDP-GlcNAc /GalNAc外,化學途徑還可以實現其他糖核苷酸的合成,如UDP-4-脫氧-α-D-木糖吡喃糖(UDP-D-Glc[38]、UDP-N-乙酰胞壁酸[27]、UDP-D-巖藻糖[39]以及GDP-D-ManA[26]。


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