聚醚抗生素Tetronasin的諸多生物合成過程已經得到推測或闡明。然而其更為復雜的雙環體系-環己烷與四氫吡喃的合成分子基礎一直不為人知。本文作者通過一系列體內敲除、體外酶學實驗驗證了其基因簇中兩個[4+2]環化酶Tsn11與Tsn15協同負責環己烷與四氫吡喃結構的生物合成過程：Tsn11介導了逆電子需求的Diels-Alder反應形成oxadecalin中間體4(逆電子D-A反應詳見往期推薦1)，Tsn15進一步催化了分子內重排反應形成終產物中的四氫吡喃。Tsn15晶體結構的解析工作進一步表明其催化下的周環重排機理。Tsn15對其活性位點突變的耐受性及其蛋白質折疊催化的多種反應范圍進一步表明其可能具有生物催化劑的潛力。
Fig 1. The proposed roleof the [4+2] cyclasehomologues Tsn11 and Tsn15 in tetronasin biosynthesis.
5: 參考文獻： https://www.nature.com/articles/s41929-019-0351-2
聚醚抗生素Tetronasin (1)產于Streptomyces longisporoflavus，是一種罕見的含有�；卮八岵糠值木勖央x子載體(特窗酸、特窗胺及其衍生物均是生物活性很高的五元雜環化合物，具有重要的研究與實用價值)，已發現可用作抗生素和抗寄生蟲劑。Tetronasin(1)的生物合成部分歷程已經得到推測或闡明(Fig 1)，諸如其結構中聚酮骨架的合成（2）、特窗酸與四氫呋喃結構的形成（3）。然而其結構中更為復雜的雙環體系-環己烷與四氫吡喃的生物合成分子基礎一直不為人知。
Fig 1. The proposed roleof the [4+2] cyclasehomologues Tsn11 and Tsn15 in tetronasin biosynthesis.自然界中，包括抗生素spirotetronate和spirotetramate在內的很多天然產物的復雜多環結構均依賴一類[4+2]環化酶(Diels-Alderase)催化的Diels–Alder反應，由富電性的共軛二烯與缺電性的親二烯體通過[4+2]環化加成得到。據此，本文作者首先對Tetronasin的基因簇(tsn)進行了詳盡的生物信息學分析，他們驚訝地發現其中存在兩個未知酶（Tsn11與Tsn15）均與[4+2]環化酶具有一定的同源性(Fig 2a)，隨即對Tsn11和Tsn15的基因敲除和回補實驗發現Tsn11和Tsn15對產生終產物1必不可少(Fig 2b)，同時積累到少量的中間體3。接下來，他們對這兩個酶進行了異源表達并詳細驗證了Tsn11和Tsn15的體外活性： Tsn11催化了非經典的逆電子需求的Diels-Alder反應將3轉化為4，而Tsn15可能負責了4的進一步分子內重排反應產生終產物1。
Fig 2. Functional characterizationof the Diels-alderase homologues Tsn11 and Tsn15 in tetronasin biosynthesis.
為了進一步了解Tsn15催化重排的反應機理，作者分別獲得了Tsn15和與底物4的共結晶的晶體結構。他們發現Tsn15單體通過N端α螺旋的相互作用形成二聚體，而C端的β-桶狀結構域形成了疏水的空腔容納了底物。此外，他們發現共結晶后的底物并不是預期的底物4，而是已經經歷了自發脫水形成了“酶促反應惰性”的5。他們隨即通過突變空腔內的可能的催化位點，證明了Tsn15催化的反應并不屬于酸/堿的催化機理，反而W190與5中oxadecalin結構的π-堆積相互作用是催化活性的關鍵，這暗示了預期底物4在Tsn15催化的反應過程中極有可能是通過由空腔疏水作用介導的周環重排反應而產生終產物1。此外，盡管4與5的相互轉化過程是否是Tsn15介導的酶促反應仍然不明，但作者推測5可能是Tsn15的真實底物，因為4中半縮醛的脫水對后續的重排反應過程可能形成的陰離子具有穩定化作用。
Fig 3. Structure ofTsn15 and a Tsn15-substrate complex and a proposed mechanism for formation ofthe cyclohexane and tetrahydropyran rings of tetronasin.綜上，本文發現酶Tsn11催化逆電子需求的雜Diels-Alder反應，而與已知Diels-Alderase環化酶在結構上同源的Tsn15已經進化出催化不同反應的功能（但也可能是周環反應）。從合成生物學的角度來看，這些酶可用于立體合成聚醚離子載體類似物中的環己烷和四氫吡喃部分。Tsn15對其活性位點突變的耐受性及其蛋白質折疊催化的多種反應范圍進一步表明其可能具有生物催化劑的潛力。同時，這些發現表明，在天然產物的生物合成途徑中仍存在更多新的和潛在的酶促周環反應例子。
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